A. Introducción

Como se ha vista anteriormente, la detección de patógenos en los alimentos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se trata de un método de investigación de ausencia /presencia y, por tanto, se trata de un método cualitativo.
En los métodos de investigación de ausencia/presencia basados en la identificación mediante PCR "clásica" se diferencian, principalmente, 5 fases.
Sin embargo, cuando se utiliza PCR cuantitativa o PCR a tiempo real (qPCR) las fases de amplificación, detección tienen lugar en una única fase. Además, en algunos casos dependiendo del mecanismo de detección, también se produce la confirmación del producto de PCR.

B. PCR a tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR)

PCR a tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR)
Como se ha visto, la tecnología de la PCR cuantitativa a tiempo real combina el método de amplificación de ADN convencional, la PCR, con la utilización de fluorocromos para poder monitorear paso a paso y de manera cuantificable el proceso de amplificación de un segmento especifico de ADN de interés. Por tanto, la amplificación y la detección se realizan a la vez y de forma automatizada.
Como vimos en el ejercicio anterior, estos fluorocromos determinan dos tipos de mecanismos de detección: - Mecanismos de detección no específicos, detectan todos los ADN de cadena doble producidos durante la reacción de amplificación, ya sean productos específicos, productos inespecíficos o dímeros de "primers". Consisten en añadir un agente intercalante de la doble cadena o un fluorocromo que emite fluorescencia cuando se une a ella. El más utilizado es el SYBR Green I. - Mecanismos de detección específicos, son capaces de distinguir entre el fragmento de interés y los dímeros de "primers" o las amplificaciones inespecíficas. Todos se basan en la utilización de una sonda marcada específica para hibridar con dicho fragmento de interés. Las sondas se marcan con fluorocromos y "quenchers". El fluorocromo absorbe energía y pasa a un estado excitado, posteriormente, al volver al estado inicial emite el exceso de energía en forma de fluorescencia. Los "quenchers" (extintores) son moléculas que aceptan la energía de un fluorocromo y la disipan en forma de calor o fluorescencia. Existen distintos tipos de sondas: "TaqMan®", "Molecular Beacons", "Light Cycler", etc. Únicamente se detecta el fragmento de interés, por lo que además de la amplificación y la detección tiene lugar, al mismo tiempo, la confirmación del producto de PCR.
Sondas TaqMan®
Este método se basa en la actividad 5'-exonucleasa de la Taq polimerasa y en la amplificación mediante PCR de una determinada secuencia diana en presencia de una sonda fluorescente específica, que hibrida con la secuencia diana que estamos amplificando. La sonda TaqMan®, de un tamaño aproximado de 20-30 bases, tiene unido un fluorocromo en posición 5' y una molécula que absorbe, amortigua la fluorescencia ("quencher") en posición 3'. Además esta sonda está fosforilada en 3' para evitar su extensión durante la reacción de PCR. Si la secuencia diana está presente en la muestra, la sonda TaqMan hibridará específicamente con ella, situándose entre los dos cebadores. Cuando se produce la etapa de extensión en la reacción de PCR, la actividad 5'-exonucleasa de la Taq polimerasa degrada a la sonda TaqMan® liberando el fluorocromo, que al quedar separado del amortiguador emitirá una señal, que puede ser captada por el sistema óptico del equipo. Este proceso de degradación de la sonda tiene lugar en cada ciclo y es directamente proporcional al número de moléculas que están siendo sintetizadas.
La fluorescencia, medida al completar cada ciclo de PCR, se representa en una "gráfica de amplificación" para determinar el ciclo umbral (Ct-cycle threshold). El Ct se define como el punto en el que se detecta por primera vez la señal fluorescente, es decir, el producto de la PCR.
En la actualidad existen distintos sistemas comerciales de identificación de microorganismos patógenos en muestras de alimentos y muestras ambientales basados en la qPCR: Bax System (de Dupont), TaqMan detection kits (de Life Technologies), Sistema iQ-Check (de Bio-Rad), etc.
En este ejercicio vamos a describir un protocolo de Investigación de presencia/ausencia de Salmonella mediente un kit comercial de qPCR, basado en sondas Taqman: "MicroSEQ® Salmonella spp. Detection Kit"

 

C. Fases del método

Fase 1. Preparación de la muestra y enriquecimiento en medio líquido
Fase 2. Extracción de ácidos nucleicos
Fase 3. Identificación por qPCR (amplificación por PCR, detección del fragmento amplificado y confirmación del fragmento amplificado con sondas TaqMan)

D. Fase1: Preparación de la muetra y enriquecimiento en medio líquido

Homogeneización y enriquecimiento primario
Enriquecer la muestra en caldo selectivo. Para ello. pesar x gramos de muestra en un recipiente o una bolsa de plástico estéril, previamente tarada, añadir 9x mL del caldo Müller Kauffmann tetrationato/novobiocina (MKTTn). Homogeneizar en un Stomacher y llevar a incubar a 37±1 ºC durante 16-20 horas.
Enriquecimiento secundario
Diluir la muestra enriquecida con Agua de Peptona Tamponada (BPW, Buffered Peptone Water) con una proporción 1:9; por ejemplo, llevar 1 mL de muestra enriquecida a 9 mL de BPW en un recipiente estéril. Incubar 37±1°C durante 5±1 horas.

 

 

E. Fase2: Extracción de ácidos nucleicos

Para realizar la extracción de ácidos nucleicos (ADN) se pueden utilizar kits comerciales. En este caso el "PrepSEQ® Rapid Spin Sample Preparation Kit – Extra Clean with Proteinase K". Este kit proporciona un método sencillo para preparar ADN a partir de distintos tipos de muestras (ambientales, alimentos, etc). El kit se compone de: - Columnas de centrifugación - Tubos de centrifugación - Tampón de lisis (Lysis Buffer) - Proteinasa K
Insertar una columna de centrifugación en un tubo eppendorf. Cargar 750 μL de muestra enriquecida en la columna de centrifugación y tapar la columna.
Centrifugar 3 minutos a 12.000-14.000 x g.
Tras la centrifugación, desechar la columna de centrifugación usada y eliminar el sobrenadante. Aspirar toda la cantidad de sobrenadante que sea posible, incluido el exceso de líquido de los laterales del tubo para tratar de dejar el precipitado lo mas limpio posible. Resuspender el precipitado en 50 μL de Lysis Buffer.
Incubar a 97±2 °C durante 10 minutos para que se produzca la rotura celular.
Añadir 250 μL de Nuclease-free Water. Mezclar bien.
Centrifugar 2 minutos a 12.000-14.000 x g para eliminar los restos celulares.
Recoger la muestra de la parte transparente central (fase acuosa) que es donde se encuentra el ADN. En las muestras con un alto contenido en grasa, se puede formar una capa superior. También se forma un precipitado con los restos.

F. Fase 3: Identificación por PCR

Principio del test
En esta fase utilizaremos el "MicroSEQ® Salmonella spp. Real-Time PCR Detection Kit". Este kit permite determinar la presencia de ADN de Salmonella spp. en muestras ambientales y de alimentos. La detección de ADN se realiza por PCR en tiempo real utilizando dos sondas TaqMan. - Una marcada con fluorocromo FAM™ que complementa con una secuencia de ADN específica de Salmonella spp. - La otra marcada con otro fluorocromo VIC® que complementa con una secuencia no específica que se utiliza como control positivo interno (IPC) para descartar inhibidores en la muestra y para comprobar el correcto funcionamiento del ensayo. Por tanto, se producirá en el mismo tubo, una reacción en cadena de la polimerasa múltiple (PCR Múltiple) en la que se amplifican simultáneamente dos loci, uno específico ADN de Salmonella spp. y otro control (control positivo interno; IPC).
Amplificación
El kit se compone de: - Salmonella spp. Assay Beads, 96 tubos con microesferas en tiras de 8 tubos (96 reacciones/kit) - MicroAmp® Optical 96 tapones ópticos en tiras de 8 - Pathogen Detection Negative Control (1,5 mL)
Sacar de la bolsa la cantidad adecuada de tubos con microesferas (un tubo por cada muestra + un tubo por cada control) y colocarlos en hielo o en un bloque frío. También, colocar las muestras y los controles en hielo o en un bloque frío.
Añadir 30 μL de cada muestra a cada tubo con microesferas. Dispensar todas las muestras primero y, después, el control o los controles negativos y por último el control o los controles positivos. Volumen final de reacción 30 μL. Las microesferas se disuelven en un plazo de 1 a 5 segundos. Mezclar suavemente con la pipeta y tapar con los tapones ópticos suministrados en el kit. NOTA: los tubos con microesferas contienen todos los componentes necesarios para cada reacción: primers, oligonucleótidos (dNTPs), polimerasa y su tampon, sondas TaqMan, etc.
Llevar los tubos al termociclador. Programar los siguientes ciclos: Temperatura Tiempo Ciclos 95 ºC 2 minutos 1 95 ºC 3 segundos 40 60 ºC 30 segundos
Controles recomendados
Cuando se realizan este tipo de análisis se deben poner unos controles externos (además del control interno que proporciona el kit). Los recomendados son: - Control negativo de extracción: extracción realizada sin muestra de partida. Este control evita falsos positivos debidos a contaminación cruzada (contaminación de los reactivos de extracción con ADN con el microorganismo bajo estudio). - Control negativo de PCR: PCR realizada sin ADN. En este caso, este control lo facilita el kit (Pathogen Detection Negative Control). Este control evita falsos positivos debidos a contaminación cruzada (contaminación durante el proceso de amplificación (de los reactivos de amplificación) con el microorganismo bajo estudio). - Control positivo de extracción: extracción realizada partir de una muestra conocida positiva. Este control evita falsos negativos debidos a la obtención de ADN no amplificable (cantidad y/o calidad del ADN insuficiente). - Control positivo de PCR: PCR realizada con ADN del microorganismo diana obtenido de una cepa de referencia. Este control evita falsos negativos debidos a problemas en la amplificación propiamente dicha (con los reactivos, condiciones de amplificación, inhibición de la ampificación, etc.) .

G. Interpretación de los resultados

Interpretación de los resultados
Antes de analizar los resultados de las muestras, debemos comprobar que los resultados obtenidos con el control son los esperados:
* Controles Positivos: El resultado debe ser siempre positivo (la señal de fluorescencia supera el umbral:thresholdl) en las dos reacciones de amplificación. Tanto la del control positivo interno marcada con el fluorocromo VIC® como la de la secuencia de ADN específica de Salmonella marcada con el fluorocromo FAM™ * Controles Negativos: El resultado de la amplificación del control positivo interno marcada con el fluorocromo VIC® debe ser siempre positivo. El resultado de la secuencia de ADN específica de Salmonella spp. marcada con el fluorocromo FAM™ será negativo ya que no existe ADN de Salmonella spp.	Salmonella spp. (FAM™) IPC (VIC®) Interpretación + + Controles Positivos - + Controles Negativos
* Muestra: Para que el análisis sea válido, el resultado de la amplificación del control positivo interno marcada con el fluorocromo VIC® debe ser positivo. Si bien en las muestras positivas se acepta que el resultado negativo en la reacción del IPC se debe un elevado número de copias del ADN en las muestras, lo que causa la amplificación preferencial del ADN específico de Salmonella spp. El resultado de la secuencia de ADN específica de Salmonella spp. marcada con el fluorocromo FAM™ será positivo cuando la muestra contenga presencia de ADN de Salmonella y negativo cuando no exista ADN de Salmonella spp. en la muestra.	Salmonella spp. (FAM™) IPC (VIC®) Interpretación + +/- Muestra Positiva. - + Muestra Negativa. - - Resultado no válido. Presencia de inhibidores de PCR en la muestra.
Resultado Muestra Positivo (Rosa; FAM™- Gris;VIC®) Resultado Muestra Negativo (Rosa; FAM™- Gris;VIC®)
Expresión de los resultados
- Resultado negativo: "Ausencia de Salmonella spp. en x gramos de muestra analizada". - Resultados positivo: "Presunta presencia de Salmonella spp. en x gramos de muestra analizada". El resultado debe ser confirmado, a partir del caldo de enriquecimiento BPW por algún método clásico (por ejemplo el métood descrito en la norma ISO).

H. Supuesto práctico

Caso Práctico En el laboratorio se reciben 3 muestras de carne separada mecánicamente. Se procede a analizar la presencia/ausencia de Salmonella spp. en 25 gramos de cada muestra mediante el método de qPCR descrito en este ejercicio. Los resultdos obtenido se muestran a continuación.
1 2 3 4 5 6 7 8 A 30 µl ADN Muestra#1 30 µl ADN Muestra#2 30 µl ADN Muestra#3 30 µl Control positivo de extracción 30 µl Control positivo PCR   30 µl Vial Control negativo PCR 30 µl Control negativo de extracción
Resultados obtenidos
Resultados controles	Pregunta
Salmonella spp. (FAM™) IPC (VIC®) Control negativo de extracción - + Control negativo de PCR - + Control positivo de extracción + + Control positivo de PCR + -	1. En vista de los resultados obtenidos en los controles de este supuesto práctico, considera: a) Que los resultados no son los esperados y, por tanto, en ensayo es invalido. b) Que el ensayo es válido, por tanto, pasaremos a analizar los resultados obtenidos en las distintas muestras.
Muestra#1 (Rosa; FAM™- Gris;VIC®)	Pregunta
	2. En vista de los resultados obtenidos en la muestra #1 de este supuesto práctico (pocillo #1), considera que: a) El resultado es inválido porque en el control positivo interno no hay amplificación. b) En la muestra no se detecta ADN específico de Salmonella spp. c) En la muestra se detecta a presencia de ADN específico de Salmonella spp. 3. El informe de resultados de esta muestra dirá: a) Presencia de Salmonella spp. en 25 gramos. b) Ausencia de Salmonella spp. en 25 gramos. c) Repetir el ensayo, datos no concluyentes.
Muestra#2 (Rosa; FAM™- Gris;VIC®)	Pregunta
	4. En vista de los resultados obtenidos en la muestra #2 de este supuesto práctico (pocillo #2) y dado que el kit empleado utiliza sondas TaqMan para la detección, considera que: a) Se ha producido hibridación de la sonda con la secuencia diana específico de Salmonella spp. y su posterior degradación por la Taq polimerasa durante la fase elongación liberandose así el fluorocromo (FAM™). b) Se ha producido hibridación de la sonda con una no específica de Salmonella spp usada como IPC y su posterior degradación por la Taq polimerasa durante la fase elongación liberandose así el fluorocromo (VIC®). c) Ambas respuestas a) y b) son correctas. 5. El informe de resultados de esta muestra dirá: a) Presunta presencia de Salmonella spp. en 25 gramos. Confirmar los resultados a partir del caldo de enriquecimiento en agua de peptona tamponada. b) Presunta presencia de Salmonella spp. en 25 gramos. Confirmar los resultados repitiendo el ensayo de qPCR. c) Presencia de Salmonella spp. en 25 gramos.
Muestra#3 (Rosa; FAM™- Gris;VIC®)	Pregunta
	6. En vista de los resultados obtenidos en la muestra #3 de este supuesto práctico (pocillo #3), considera que: a) El resultado es inválido porque en el control positivo interno no hay amplificación. b) En la muestra se detecta a presencia de ADN específico de Salmonella spp. c) Ambas respuestas a) y b) son correctas. 7. El informe de resultados de esta muestra dirá: a) Presunta presencia de Salmonella spp. en 25 gramos. Confirmar los resultados. b) Presunta ausencia de Salmonella spp. en 25 gramos. Confirmar los resultados. c) Repetir el ensayo, datos no concluyentes.

 

I. Comprobar respuestas