A. Introducción

Staphylococcus aureus es una especie bacteriana integrada por cocos (de 0,8-1,0 mm de diámetro) Gram positivos que se dividen en más de un plano, por lo que se agrupan irregularmente en racimos. Son inmóviles y no forman esporas. Anaerobios facultativos y catalasa positivos. Algunas cepas de S. aureus son patógenas para el hombre. Puede producir infecciones generalizadas además de lo que se conoce como intoxicación estafilocócica. Ésta es una intoxicación alimentaria resultados del consumo de alimentos en los que S. aureus se ha multiplicado y producido enterotoxina/as (conocidas como Staphylococcal EnteroToxins; SET). La dosis infectiva es alta ya que es necesario un número de al menos 106 UFC/g para producir cantidad suficiente de enterotoxina para producir la enfermedad en el consumidor. Es común referirse a las cepas de estafilococos coagulasa positivas y DNAsa termoestable positivas como potencialemente productores de enterotoxinas, aunque no todas las cepas con estas propiedades las producen realmente, sino sólo un porcentaje de ella, variable con su origen.
Dado que es un microorganismo presente en la flora normal de los animales de sangre caliente (más del 50 % de las personas son portadoras de S.aureus en fosas nasales, garganta, manos, pelo, etc.) y se trata de una especie muy sensible a la acción del calor y de los desinfectantes, su presencia en determinados niveles en los alimentos indica higiene defectuosa por mala manipulación. Si, además, los S. aureus aislados son cepas enterotoxigénicas, suponen un riesgo para la salud. Puede ocurrir que no se detecte S. aureus en un alimento, que el número detectado sea pequeño y que, sin embargo, exista cantidad detectable suficiente de enterotoxina estafilocócica. En este caso, los microorganismos que originaron la toxina han ido descendiendo en número e, incluso, desapareciendo, mientras que la toxina, por su mayor resistencia, permanece en el alimento.
En este ejercicio, veremos el método para el recuento en placa de Staphylococcus aureus coagulasa positivos basado en la norma ISO 6888.

B. Medios de cultivo y reactivos

• Diluyente: Generalmente, agua de peptona o triptona al 0,1%.
  Aunque pueden usarse otros diluyentes dependiendo de las características de la muestra, tal y como recogen las distintas partes de la norma ISO 6887
  
  
• Agar Baird Parker (BP).
  
• Caldo cerebro corazón (Brain Heart Infusión: BHI).
  
• Plasma de conejo con ácido etilen diamino tetraacético (EDTA)
  Plasma de conejo, desecado y titulado, que evita reacciones falsas en la prueba de la coagulasa. Este producto se adquiere en casas comerciales.

C. . Preparación de la muestra, suspensión inicial y diluciones decimales seriadas

Se llevará a cabo según la Norma ISO 6887, dependiendo del tipo de producto.
Preparación de la suspensión inicial
Preparar la dilución inicial o dilución 10-1. Para ello, pesar 10 gramos de muestra en una bolsa de Stomacher, previamente tarada, mezclar con 90 mL de agua de triptona al 0,1% (x gramos de muestra + 9x mL de diluyente) y homogeneizar en el Stomacher durante 1 a 3 minutos. El tiempo varía según el tipo de alimento.
Preparación de diluciones decimales seriadas
A partir de la primera dilución (10-1 ó 1/10), se preparan diluciones de 1 en 10 sucesivas. Con una pipeta o punta estéril, tomar 1 mL de la dilución inicial y añadirlo a 9 mL de agua de triptona al 0,1%. Tendremos la dilución 10-2. Para obtener las diluciones siguientes hay que tomar 1 mL de la dilución anterior y añadirlo a otro tubo con 9 mL de diluyente, así hasta obtener las diluciones necesarias.
Como hemos visto en anteriores recuentos, el número de diluciones a realizar depende de: Si queremos conocer la flora del alimento respecto al parámetro que estemos analizando, en cuyo caso dependerá del número de microorganismos que se espera encontrar, cuanto mayor sea el número de microorganismos que esperamos más diluciones decimales deben hacerse del alimento. Si queremos conocer si la muestra que estamos analizando cumple un límite microbiológico establecido en la legislación, en cuyo caso dependerá del valor de dicho límite.

 

D. Procedimiento

Siembra placas de agar Baird Parker mediante extensión en superficie
Partiendo de las diluciones decimales, sembrar 0,1 ml por duplicado, en placas Baird Parker, mediante extensión en superficie.
Incubar a 37ºC durante 48 ± 2 horas. Después de la incubación, examinar las placas para ver la presencia de colonias sospechosas de S. aureus

 

E. Interpretación de los resultados

Crecimiento típico de S. aureus en Agar Baird Parker
Las colonias típicas de Staphylococcus aureus sobre agar Baird-Parker son redondas, de bordes lisos, convexas, de 2-3 mm de diámetro, húmedas, brillantes, negras, con un borde blanco fino, rodeadas de una zona opaca y de un halo claro de 2-5 mm. Fundamento: El cloruro de litio y el telurito potásico que forman parte del medio inhiben el desarrollo de la flora competitiva; el piruvato sódico y la glicocola favorecen el crecimiento de los estafilococos. El medio de cultivo es opaco, debido a que se le incorpora emulsión de yema de huevo. S. aureus sintetiza una lipasa que, al actuar sobre la lipoproteina de la yema de huevo, produce un aclaramiento alrededor de las colonias. Alrededor de las colonias se forma también una zona opaca como consecuencia de la formación de un precipitado de sales de calcio y magnesio, insoluble en ácidos grasos. Esta zona opaca se hace más visible a partir de las 24 horas de incubación. El aclaramiento del medio que rodea a las colonias junto con el color negro brillante de las mismas, son las características típicas mas visibles de las colonias típicas.	Colonias típicas
Las colonias que no presentan ese color negro brillante o que no tienen alrededor un halo claro de lipolisis son consideradas atípicas y desechadas.	Colonias atípicas
Recuento de colonias sospechosas
Después del periodo de incubación, examinar las placas y seleccionar las placas que contengan hasta 150 colonias típicas de S. aureus (y hasta 300 colonias totales típicas y no típicas). Para realizar el cálculo se eligen las placas de dos diluciones sucesivas donde al menos una placa de las seleccionadas contenga un mínimo de 10 colonias típicas. A continuación, debemos debemos hacer confirmación/identificación de las colonias sospechosas contadas.	Dilución 10-1 Dilución 10-2 Dilución 10-3 Dilución 10-4 Número de Colonias 134 típicas 213 totales 15 típicas 23 totales 2 típicas 3 totales 0 típicas 0 totales 142 típicas 228 tota 14 típicas 26 totales 1 típicas 5 totales 0 típicas 0 totales Seleccionaremos dos diluciónes consecutivas, en este caso las diluciones 10-1 y 10-2

 

 

F. Entrenamiento en la distinción y recuento de colonias de Staphylococcus aureus

Analice cada placa y conteste a la pregunta en la columna de la derecha haciendo clic sobre la letra (en azul) que precede a la contestación u opción que crea correcta.
	Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan : a ) características típicas de S. aureus b ) características atípicas de S. aureus
	Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan : a ) características típicas de S. aureus b ) características atípicas de S. aureus
	Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan : a ) características típicas de S. aureus b ) características atípicas de S. aureus
	Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan : a ) características típicas de S. aureus b ) características atípicas de S. aureus
	Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan : a ) características típicas de S. aureus b ) características atípicas de S. aureus
	En esta placa de Baird Parker : a ) aparecen colonias típicas de S. aureus b ) no aparecen colonias típicas de S. aureus
	En esta placa de Baird Parker : a ) aparecen colonias típicas de S. aureus b ) no aparecen colonias típicas de S. aureus
	En esta placa de Baird Parker : a ) aparecen colonias típicas de S. aureus b ) no aparecen colonias típicas de S. aureus
	En esta placa de Baird Parker : a ) aparecen colonias típicas de S. aureus b ) no aparecen colonias típicas de S. aureus

 

G. Confirmación de colonias sospechosas

Confirmación de colonias
Para confirmar las colonias contadas como S. aureus es necesario comprobar que un número representativo de ellas (un 10% o un mínimo de 5) son coagulasa positivas (es decir que dan un resultado positivo en la prueba de la coagulasa). La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la fibrina del plasma. La mayoría de las cepas de Staphylococcus aureus patógenas (enterotoxigénicas) producen esta enzima.
Las colonias típicas seleccionadas se siembran en caldo infusión cerebro-corazón, BHI (Brain Heart Infusion) contenido en tubos.
Incubación: Incubar a 37 ºC durante 18-24 horas.
Prueba de la coagulasa: En un tubo de 10 x 75 mm estéril, se vierten 0,3 ml. de plasma de conejo EDTA reconstituido. Se añade 0,1 ml. del cultivo obtenido en caldo BHI. Mezclar suavemente
Incubación: Incubar a 37 ºC y examinar a las 6 horas de incubación.
Coagulasa positiva La reacción es positiva cuando el coágulo formado es firme.
Coagulasa negativa La reacción es negativa cuando no se coagula el plasma.

 

 

H. Cálculo y expresión de resultados, en los métodos de recuento en placa con identificación.

Cálculo de resultados

Del número de colonias características/sospechosas que se resiembran (A), las colonias que han dado positivo en la prueba de la coagulasa son las colonias que responden a los criterios de identificación (b) y, por tanto se confirman como S. aureus.  A partir de los resultados de la confirmación/identificación, se calcula el número de colonias después de la identificación/confirmación (Σa), según la siguiente expresión:

Finalmente, se calcula el número de Unidades Formadoras de Colonias por gramo o mililitro (N), según la siguiente expresión:

I. Supuesto práctico

Se hace un recuento de S. aureus coagulasa positivos en una muestra de carne picada. Observe las placas y después conteste a las preguntas.
Los resultados obtenidos en los duplicados de este supuesto práctico han sido los siguientes
Placas de Baird Parker (Haga clic sobre la placa para verla a más aumento)
	Duplicado A	Duplicado B
10-1
10-2
10-3
Tras el recuento inicial de colonias sospechosas, se somete a confirmación 4 de ellas (A), los resultados obtenidos se muestran a continuación. Resultado de la prueba de la coagulasa:
Colonia #1
Colonia #2
Colonia #3
Colonia #4

 

J. Contestación a las preguntas

Una vez interpretado los resultados conteste a las siguientes preguntas haciendo clic en los radiobotones de la opción correcta

1- A la vista de los resultados, para realizar el recuento de S. aureus coagulasa positivos, qué diluciones utilizaría para calcular el número de UFC/g:

a) Dilución 10^-1 y 10^-2
b) Dilución 10^-2 y 10^-3
c) Dilución 10^-3

2- Cuál es el 'ΣC':

a) 439
b) 70
c) 7

3- El nivel de dilución correspondiente a la primera dilución retenida ha sido de:

a) 1/100
b) 1/1000
c) 1/10000

4- El número de colonias que responden a los criterios de identificación (b) son:

a) 4
b) 5
c) 1

5.- Finalmente, el Número de Unidades Formadoras de Colonia de S. aureus coagulasa positivos por gramo de muestra es:

a) N= 7 x 10⁵ UFC/g de S. aureus coagulasa positivos
b) N= 3,5 x 10⁵ UFC/g de S. aureus coagulasa positivos
c) N= 1,6 x 10⁴ UFC/g de S. aureus coagulasa positivos

 

K. Comprobar respuestas