A. Introducción

Características generales de Shigella

Shigella es un género bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, integrado por bacterias de forma bacilar, no esporuladas e inmóviles. Los microorganismos del género Shigella, generalmente, no producen gas de la glucosa, son inmóviles, no producen sulfuro de hidrógeno, no descarboxilan la lisina y son lactosa negativas. El resto de pruebas dan reacciones diferentes según las especies. Existen cuatro especies principales de bacterias del género Shigella que provocan disentería bacilar: Shigella sonnei, S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii. S. sonnei es más frecuente en países desarrollados (Europa y Estados Unidos) y suele provocar infecciones leves. S. dysenteriae y S. flexneri causan cuadros más graves y son más frecuentes en el sudeste asiático, América del sur y central y África central.

 

B. Medios de cultivo

• Caldo de cultivo pH 8
• Agar Salmonella-Shigella (S-S)
• Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (Xylose Lysine Desoxycholate: XLD)
• Agar MacConkey
• Agar lisina hierro (Lysine Iron Agar: LIA)
• Agar TSI ó Kligler
• Caldo Urea
• Galerías API 20E

C. Fases del aislamiento e identificación de Shigella

1. Enriquecimiento selectivo en medio líquido.
2. Aislamiento diferencial sobre medios sólidos selectivos.
3. Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas.
   
   
   

D. Fase 1.-Enriquecimiento selectivo en medio líquido

En esta fase, se limita la proliferación de la flora competitiva y se estimula el crecimiento de Shigella.
El volumen de muestra a analizar depende del tipo de agua. Para volúmenes inferiores a 10 mL Inocular un matraz con 50 mL de Caldo Shigella con 0,5 microgramos de novobiocina con la muestra (1 mL, 10 mL, etc.). Para volúmenes superiores a 10 mL Filtrar el volumen adecuado (100 mL, 1.000 mL, etc.) a través de un filtro de membrana de 0,45 micras de diámetro de poro. Una vez finalizada la filtración, recoger el filtro y colocar dentro de un matraz con 50 mL de Caldo Shigella con 0,5 microgramos de novobiocina.
Incubar en anaerobiosis a 41,5±1 ºC durante 20-24 horas.

E. Fase 2.-Aislamiento diferencial en medios sólidos selectivos

En esta etapa se utilizan medios de cultivo diferenciales que por su composición permiten que las colonias de Shigella crezcan con un aspecto característico en cada uno de ellos (colonias típicas)
A partir del cultivo obtenido en la fase de enriquecimiento, sembrar, por duplicado, con asa de cultivo sobre: Agar Salmonella-Shigella (S-S)
Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato (Xylose Lysine Desoxycholate: XLD)
Agar MacConkey
AGAR SALMONELLA-SHIGELLA (S-S): CRECIMIENTO CARACTERÍSTICO (Haga clic sobre la imagen para ampliar)
Las colonias sospechosas de Shigella crecidas en Agar Salmonella-Shigella son transparentes, translúcidas u opacas y suelen ser lisas. En este medio las colonias de otros microorganismos que fermentan la lactosa (coliformes) son colonias rojizas y en muchos casos mucoides.	COLONIAS SOSPECHOSAS
AGAR XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO (XLD): CRECIMIENTO CARACTERÍSTICO (Haga clic sobre la imagen para ampliar)
Las colonias sospechosas de Shigella crecidas sobre Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) son transparentes y del mismo color que el medio de cultivo (rojo). Este género bacteriano al no fermentar la xilosa, la lactosa ni la sacarosa, no da lugar a que vire a amarillo el rojo fenol. Como tampoco descarboxilan la lisina, no se produce color rojo púrpura alrededor de las colonias, al no haberse producido cadaverina.	COLONIAS SOSPECHOSAS
AGAR MAC CONKEY: CRECIMIENTO CARACTERÍSTICO (Haga clic sobre la imagen para ampliar)
Las colonias sospechosas de Shigella en Agar MacConkey son incoloras y transparentes. En este medio las colonias de otros microorganismos que fermentan la lactosa (coliformes) son colonias rojizas.	COLONIAS SOSPECHOSAS

Le aconsejamos que se ejercite en la interpretación de las imágenes comprobando su correcta interpretación haciendo clic en cada pregunta en la letra azul que antecede a la opción que le parezca correcta. Debe seleccionar las placas de los distintos medios selectivos en las que observe un crecimiento típico de Shigella.
Ejemplo 1	Ejemplo 2	Ejemplo 3
Agar S-S (Haga clic sobre la imagen para ampliar)	Agar XLD (Haga clic sobre la imagen para ampliar)	Agar MacConkey (Haga clic sobre la imagen para ampliar)
En este caso: a) Placa seleccionada b) Placa no seleccionada	En este caso: a) Placa seleccionada b) Placa no seleccionada	En este caso: a) Placa seleccionada b) Placa no seleccionada
Ejemplo 4	Ejemplo 5	Ejemplo 6
Agar XLD (Haga clic sobre la imagen para ampliar)	Agar MacConkey (Haga clic sobre la imagen para ampliar)	Agar XLD (Haga clic sobre la imagen para ampliar)
En este caso: a) Placa seleccionada b) Placa no seleccionada	En este caso: a) Placa seleccionada b) Placa no seleccionada	En este caso: a) Placa seleccionada b) Placa no seleccionada

Supuesto práctico: analizar la presencia/ausencia de Shigella en una muestra de agua de consumo humano. Volumen analizado 100 mL
Lectura de resultados sobre agar Salmonella-Shigella del supuesto práctico Se trata de interpretar los resultados obtenidos en las siembras sobre agares selectivos en busca de colonias sospechosas de Shigella. Para ello: 1º. Observe las placas buscando colonias sospechosas y no sospechosas de Shigella 2º. Conteste a las preguntas
AGAR SALMONELLA-SHIGELLA (S-S) (Haga clic sobre la imagen para ampliar)
Placa S-S1	Placa S-S2
Placa S-S3	Placa S-S4
Contestación a las preguntas 1. Se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de "agar Salmonella-Shigella": a) S-S4 b) S-S3, S-S2 c) S-S1,S-S2 2. No se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de "agar Salmonella-Shigella: a) S-S1,S-S4 b) S-S1,S-S2, S-S3 c) S-S3
AGAR XILOSA-LISINA-DESOXICOLATO (XLD) (Haga clic sobre la imagen para ampliar)
Placa XLD1	Placa XLD2
Placa XLD3	Placa XLD4
Contestación a las preguntas 3. Se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de Xilosa-Lisina-Desoxicolato: a) XLD4, XLD3 b) XLD1, XLD2 c) XLD1 4. No se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de Xilosa-Lisina-Desoxicolato: a) XLD1 b) XLD2, XLD3, XLD4 c) XLD4, XLD3
AGAR MAC CONKEY (Haga clic sobre la imagen para ampliar)
Placa Mac1	Placa Mac2
Placa Mac3	Placa Mac4
Contestación a las preguntas 5. Se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de MacConkey: a) Mac2, Mac3, Mac4 b) Mac2 c) Mac2, Mac4 6. No se han encontrado colonias sospechosas de Shigella en las placas de MacConkey: a) Mac1 b) Mac4, Mac2 c) Mac4, Mac3, Mac1

F. Fase 3.-Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas

Esta identificación se suele realizar en 2 subfases:

Subfase 4A: Identificación bioquímica inicial con unas pruebas determinadas: generalmente, fermentación de glucosa y lactosa (TSI), descarboxilación de la lisina (LIA) y utilización de la urea.

Subfase 4B: Identificación bioquímica final con un sistema multipruebas: generalmente con galerías comerciales de identificación bioquímicas multipruebas, en este caso: galería API20E. Esta subfase sólo se realiza con las cepas seleccionadas en la subfase anterior.

Selección de colonias sospechosas para confirmación y obtención de cultivos puros
Para la confirmación se toma, como mínimo, una colonia con aspecto típico de Shigella de cada uno de los medios de aislamiento selectivo utilizados.
Reaislar las colonias seleccionadas en la superficie de placas de agar nutritivo, de manera que permita el desarrollo de colonias bien aisladas. Incubar a 37±1 ºC durante 24±3 horas. Comprobar la pureza del cultivo (cultivos puros), que servirá para efectuar las pruebas confirmativas bioquímicas y serológicas.

Subfase 4A. Identificación bioquímica inicial
Aislar, como mínimo, dos colonias con aspecto típico de Shigella de cada uno de los medios de aislamiento selectivo utilizados.
Sembrar cada colonia en Agar Hierro Triple Azúcar (TSI), con aguja de cultivo, primero en el fondo por picadura y luego, en la superficie inclinada por estría.
Sembrar, por picadura en el fondo y por estría en la superficie inclinada del medio Agar Lisina Hierro (LIA).
Sembrar, con asa de siembra en Caldo Urea.
Incubar los tubos de TSI y Urea a 37 ºC durante 24 horas y los de agar LIA a 37 ºC durante 24-48 horas.
REACCIONES POSITIVAS DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS: AGAR TRIPLE-AZUCAR-HIERRO
Shigella presenta la siguiente reacción sobre TSI: - Alcalina (rojo) en la superficie inclinada. - Ácida (amarillo) en el fondo. - Sin producción de SH2 (sin ennegrecimiento del fondo del tubo).	Lactosa (-), Glucosa (+), SH2 (-) con o sin gas
AGAR LISINA-HIERRO
Shigella presenta la siguiente reacción sobre LIA: - Alcalina (color púrpura) en la superficie inclinada. - Ácida (amarillo) en el fondo. - Sin Producción de SH2 (ennegrecimiento del fondo del tubo).	LCD (-), SH2 (-)
CALDO UREA
El medio urea contiene un indicador de pH que vira a color rosa fuerte cuando la reacción es positiva. - Los microorganismos del género Shigella no son capaces de utilizar urea por tanto la reacción debe ser negativa: urea (-).	REACCIÓN NEGATIVA REACCIÓN POSITIVA
Seleccionar las colonias que muestren crecimiento característico de Shigella sobre agar TSI, se correspondan o no con la reacción positiva de dichas colonias en agar LlA (Casos 1 y 2). Seleccionar las colonias con crecimiento atípico sobre agar TSI cuando el crecimiento sobre agar LIA es típico (Caso 3). Desechar las colonias que no se correspondan con el crecimiento típico de Shigella ni sobre agar TSI ni sobre agar LIA (Caso 4).	Caso 1 Caso 2 Caso 3 Caso 4 TSI Típico Típico Atípico Atípico LIA Típico Atípico Típico Atípico   Seleccionar Seleccionar Seleccionar Desechar
De los casos selecccionado anteriormente (1, 2 y 3), desechar las colonias que den una reacción urea positiva.	TSI LIA Urea   Caso 1 Típico Típico Negativo Seleccionar Caso 1 Típico Típico Positivo Desechar Caso 2 Típico Atípico Negativo Seleccionar Caso 2 Típico Atípico Positivo Desechar Caso 3 Atípico Típico Negativo Seleccionar Caso 3 Atípico Típico Positivo Desechar

Le aconsejamos que se ejercite en la interpretación de las imágenes comprobando su correcta interpretación haciendo clic en cada pregunta en la letra azul que antecede a la opción que le parezca correcta. Debe seleccionar los tubos de las distintas pruebas bioquímicas en las que observe una reacción típica de Shigella.
Ejemplo 1	Ejemplo 2	Ejemplo 3	Ejemplo 4
Agar TSI	Agar TSI	Agar TSI	Agar TSI
En este caso: a) Tubo seleccionado b) Tubo no seleccionado	En este caso: a) Tubo seleccionado b) Tubo no seleccionado	En este caso: a) Tubo seleccionado b) Tubo no seleccionado	En este caso: a) Tubo seleccionado b) Tubo no seleccionado
Ejemplo 4	Ejemplo 5	Ejemplo 6
Agar LIA	Agar LIA	Agar LIA	Agar LIA
En este caso: a) Tubo seleccionado b) Tubo no seleccionado	En este caso: a) Tubo seleccionado b) Tubo no seleccionado	En este caso: a) Tubo seleccionado b) Tubo no seleccionado	En este caso: a) Tubo seleccionado b) Tubo no seleccionado

Lectura de resultados de la confirmación bioquímica inicial del supuesto práctico
Colonias	TSI	LIA	Urea	Contestación Preguntas
Colonia sospechosa 1				7. Esta colonia debe ser: a) Seleccionada b) Desechada
Colonia sospechosa 2				8. Esta colonia debe ser: a) Seleccionada b) Desechada
Colonia sospechosa 3				9. Esta colonia debe ser: a) Seleccionada b) Desechada
Colonia sospechosa 4				10. Esta colonia debe ser: a) Seleccionada b) Desechada
Colonia sospechosa 5				11. Esta colonia debe ser: a) Seleccionada b) Desechada
Colonia sospechosa 6				12. Esta colonia debe ser: a) Seleccionada b) Desechada
Colonia sospechosa 7				13. Esta colonia debe ser: a) Seleccionada b) Desechada

Subfase 4B. Identificación bioquímica final
Con las colonias seleccionadas en la identificación bioquímica inicial se efectúa lo siguiente:
Partiendo de los cultivos puros, y según las indicaciones del fabricante, sembrar una galería de identificación bioquímica API 20E con cada una de las colonias seleccionadas en la comprobación bioquímica inicial.

Lectura de resultados de la confirmación bioquímica final del supuesto práctico
Cepas	API20E Ayuda Interpretación Resultados	Contestación preguntas
Colonia #1(seleccionada en la identificación bioquímica)	Ver perfiles numéricos	14. La codificación corresponde a: 0104140 Shigella flexneri 0104521 Yersinia enterocolitica 2504752 Salmonella spp. 3005573 Enterobacter cloacae 0776000 Proteus mirabilis. 5044124 Vibrio cholerae 5306761 Serratia marcescens 6504750 Salmonella spp. 7704752 Salmonella spp. 1104112 Shigella sonnei
Colonia #2(seleccionada en la identificación bioquímica)	Ver perfiles numéricos	15. La codificación corresponde a: 0104452 Salmonella paratyphi A 1104112 Shigella sonnei 4104100 Salmonella gallinarum 4504010 Salmonella pullorum 5100100 Yersinia ruckeri 0676001 Proteus vulgaris 5306761 Serratia marcescens 5704552 Salmonella arizonae 6004540 Salmonella typhi 0104140 Shigella flexneri
Colonia #3(seleccionada en la identificación bioquímica)	Ver perfiles numéricos	16. La codificación corresponde a: 5044560 Escherichia coli 1104112 Shigella sonnei 7004743 Klebsiella ozaenae 0206042 Acinetobacter calcoaceticus 0104452 Salmonella paratyphi A 0774000 Proteus mirabilis 0676001 Proteus vulgaris 0104140 Shigella flexneri 5204024 Pseudomonas cepacea 6704752 Salmonella sp.
Colonia #4(seleccionada en la identificación bioquímica)	Ver perfiles numéricos	17. La codificación corresponde a: 5044560 Escherichia coli 0104140 Shigella flexneri 7004743 Klebsiella ozaenae 0104452 Salmonella paratyphi A 1104112 Shigella sonnei 0774000 Proteus mirabilis 0676001 Proteus vulgaris 5346761 Serratia marcescens 5204024 Pseudomonas cepacea 6704532 Salmonella sp.

G. Expresión de los resultados

Expresión final de los resultados de la investigación de Shigella en la muestra

Si la confirmación bioquímica ha resultado positiva para alguna de las colonias sospechosas: Expresar los resultados como: Presencia de Shigella en el volumen de muestra analizado En caso contrario, expresar los resultados como: Ausencia de Shigella en el volumen de muestra analizado

Pregunta sobre el supuesto práctico

18. El aislamiento e investigación de Shigella en la muestra del supuesto práctico ha dado como resultado: a) Presencia de Shigella en 100 mL de muestra b) Ausencia de Shigella en 100 mL de muestra

H. Obtener resultados